正常人原代角膜間質細胞的分離

   時間:2014-03-11 18:36:04
正常人原代角膜間質細胞的分離簡介
    正常人原代角膜間質細胞的分離 實驗材料:1. 完整的人角膜;2. GMF-Saline G;3. 中性蛋白酶Ⅱ;PriC……
正常人原代角膜間質細胞的分離正文
  
正常人原代角膜間質細胞的分離

實驗材料:
1. 完整的人角膜;
2. GMF-Saline G;
3. 中性蛋白酶Ⅱ;PriCellls原代細胞分離試劑盒
4. L型膠原酶,1mg/ml在DMEM/F12/GASP中;
5. GMF-Saline G配製的TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶;
6. DMEM/F12/GASP;
7. DEME/F12/2FB/GASP:DMEM/F12/GASP含2%FBS;
8. CMF/GASP;
9. 3.5cm塑料組織培養皿或6孔板;
10. 手術刀或單刃的安全刀片;
11. 細胞濾網,70μm血液尼龍過濾網;
12. 塑料刮片,「Cell Lifter」或「Cell Scraper」;
13. 彎虹膜剪,11cm(4-3/8in);
14. Jeweler』s鑷,10cm(4in);
15. 角膜剪,19mm刀刃,尖頭;
16. Colibri縫紉鉗,0.1mm;
17. SDS樣本緩衝液,使用終濃度:0.058mol/L Tris,5%丙三醇,1.67% SDS,0.02%溴酚藍;
18. PriCells原代細胞特製基礎培養基;
19. PriCells原代細胞培養特製添加劑;

實驗方法:
1. 用GMF-Saline G清洗角膜3×5min;
2. 剪除殘留的鞏膜,結膜和虹膜;
3. 加入PriCells原代細胞分離試劑盒的試劑,4℃搖床搖動過夜;
4. 將加入試劑的角膜4℃搖30min;
5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜;
6. 解剖顯微鏡下,小心去除上皮和內皮細胞;
7. 用塑料刮片輕刮基膜的上皮細胞面和內皮細胞面。顯微鏡下觀察,以確保完全去除這些細胞層;
8. 用新鮮培養基清洗角膜基質一次;
9. 用手術刀或安全刀片或精細手術剪將基質剪碎成2mm左右的小塊;
10. 用DMEM/F12/2FB/GASP配製的膠原酶37℃消化3h,直至大多數組織消失;
11. 400g離心10min,棄上清;
12. 用DMEM/F12/2FB/GASP重懸細胞,用70μm細胞濾網過濾消化液,並離心;
13. 重複上述清洗步驟2遍,每遍之後細胞計數;
14. 用MJM將分離出的間質細胞重懸並以1×104/cm2的密度接種至塑料組織培養皿;
15. 每三天更換一次PriCells原代細胞特製基礎培養基+PriCells原代細胞培養特製添加劑;
16. 當細胞達90%匯合時用胰蛋白酶消化傳代:

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