1. 細胞的沉降係數
由於解析度取決於區帶寬度和徑向路徑的比值，沉降係數相差越大細胞區帶間距離越大，同一細胞株沉降係數分佈越小細胞區帶越窄，分辨越高，越容易分離，在分離沉降係數相差很小的細胞時，應儘可能保持起始細胞懸浮液區帶寬度窄小，加樣量少，梯度柱要長，即用長離心管進行分離，以彌補沉降係數對解析度的不利影響。
2. 梯度的密度範圍
細胞密度必須大於梯度介質的最大密度，儘可能使用最小密度和最低黏度的梯度進行，以便在最短的時間內完成分離。
3. 梯度體積
分離細胞的數量和分離裝置不同，梯度的體積變化範圍很大，即梯度體積受所使用轉子和回收方法所制約，一般從5ml和1600ml不等。不像等密度離心，在很少的梯度介質里進行速度分離很難成功。
4. 細胞裝樣量
由於細胞相互作用或細胞與細胞間的締合是細胞濃度的函數。有兩個問題，一是給梯度上加多少細胞能夠獲得所需的解析度；二是細胞懸浮液的濃度多大才不至於引起細胞聚集並且能回收到適合研究用的細胞數量和細胞純度。由於各種組織來源的細胞差異很大，受污染細胞的數量和梯度介質分辨本領所限，很難制定一種普遍適用的方法，一般根據經驗確定或根據文獻報道方法進行，前面討論的理論方法在實際應用中有一定局限性。
5. 離心轉速和時間
最佳分離離心轉速的選擇受若干因素所影響，包括細胞大小和密度、介質的黏度和密度範圍。不管怎樣，所施加的離心力要足以使細胞在介質中能夠移動，並且在適當時間內遷移到一定的距離範圍。若離心轉速太低，需要離心時間太長，如在高黏度介質中分離心肌細胞時，離心時間太長會導致心肌細胞缺氧而死亡。若離心轉速太高，小細胞也快速通過梯度，甚至在較短時間內到達管底，重新與大細胞混雜在一起。因此，在速度離心中，離心轉速和時間是至關重要的，為了減少不穩定細胞受損或某些因子活性喪失，採用較高的轉速儘快完成分離。若較大的細胞沉降速度太長，可使用高粘性梯度介質，使其自愛梯度中以合適的速度沉降。
6. 穩定
分離細胞多在室溫（20~25℃）下進行，少數情況下在4℃下進行。
