隨著2010版GMP的頒布和進一步實施，無菌藥品生產中「除菌過濾工藝」的風險管理和驗證受到製藥行業的極大關注。除菌過濾器提供商提供的《標準驗證指南》（ValidationGuide）為過濾器的驗證提供標準，包括實驗室條件下進行的測試數據和標準值。例如：過濾器耐受滅菌的時間和次數、過濾器耐受的最高溫度和最大壓差、化學兼容性；過濾器溶出物和生物安全性測試，以及該條件下細菌挑戰測試和完整性測試參數等。
3M《標準驗證指南》對過濾器驗證項目做了詳盡描述，通過嚴格驗證確保過濾器應用和性能的一致性和穩定性，做到除菌過濾工藝的零風險。而對於具體藥液中的除菌過濾，溶劑、溫度、壓力、過濾時間等都與實驗室條件不同，則必須按照GMP的要求，進行工藝條件下的「再驗證」。驗證內容包括但不僅限於，藥液對除菌過濾器的影響：化學相容性試驗（Compatibilitytesting）和完整性試驗（Product-wetintegritytest）；除菌過濾器對料液的影響：溶出物試驗（Extractabletesting）和吸附試驗（Adsorptiontesting）；藥液對除菌過濾器細菌截留率的影響：細菌存活試驗（Bacterialviabilitytesting）和細菌截留試驗（Bacterialchallengetesting）。限於篇幅，本文結合理論和實際，重點介紹細菌截留實驗的原理和方法，為細菌截留實驗提供技術參考和理論依據。
除菌過濾工藝
除菌過濾的目的是從原料藥液里通過過濾去除細菌。如果產品無法進行最終滅菌，需要採用0.22mm（更小或相同過濾效力）的除菌過濾器進行除菌過濾。新版GMP附錄1「第十三章，非最終滅菌產品的過濾」第九十一條規定，與其他滅菌方法相比，除菌過濾的風險最大，因此，宜安裝第二隻已滅菌的除菌過濾器再過濾一次藥液。圖一為除菌過濾工藝的工藝流程示意圖，澄清過濾一般採用深層濾芯，去除料液中的不純物質，降低料液濁度和生物負荷度。無菌過濾點採用預過濾與除菌過濾組合的方式確保除菌效率和濾芯過濾性能的穩定性。法規要求的第一個要點是在採用除菌過濾方法時，首先確認採用的過濾器為「除菌級」，達到此要求后，除菌過濾法中的其它無菌保障措施才有意義。定義過濾器是否為除菌級，需要依靠過濾器的微生物截留能力，並完成相關的標準方法驗證和工藝驗證。目前業界缺乏統一標準來衡量孔徑，孔徑的標準對預測微生物截留和比較不同生產商生產的過濾器沒有實際的意義，因而，需要用微生物截留能力來定義除菌級過濾器（2010版-無菌製劑GMP實施指南）。以此可以看出細菌截留試驗對於除菌濾芯驗證的重要性。
細菌截留實驗準備
新版GMP實施指南中提到除菌級過濾器驗證的兩個主要因素：一是濾膜的級別，要求可適用的標準化試驗或類似的方法以細菌挑戰的方式進行；二是工藝驗證，由過濾器的使用者或指派的實驗設施（例如，過濾器的生產者或協議實驗室），使用有代表性的微生物進行挑戰，證明過濾器在生產條件下，可以完全去除每個產品或產品家族中的微生物。應建立針對每個產品組的科學解釋並可能需要在實施驗證前經合適的監管機構審查。細菌截留實驗就可以完全驗證過濾濾芯的細菌截留性能，也可以充分反映整個工藝環節對濾芯過濾性能的影響。因此，在截留試驗前必須做好如下準備：
過濾工藝評估：通過驗證服務調查問卷，客戶溝通甚至現場拜訪，需要完全了解客戶工藝流程，包括溶劑性質（例如水基的、酸、鹼、有機的）、過濾時間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過濾器設計規範，實驗室根據具體的情況，再結合過濾器本身的一些特性，模擬縮小化的工藝流程，這些流程需要與實際工藝流程相符或者更為惡劣，確保細菌截留實驗完全按照或者更高於實際工藝制定。
細菌培養和篩選：細菌截留試驗採用缺陷假單胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146），要求通過光學顯微鏡或者掃描電鏡觀察，直徑為0.3-0.4微米,長度為0.6-1.0微米，且呈單分散狀態，這些重要特性需每次進行觀察和篩選，以免對截留試驗造成影響。
膜片準備：根據PDA26號報告，至少應該選擇3個批號濾膜，且需有一個批號的濾膜靠近該膜片的最小臨界值。並且在進行細菌挑戰前和后，這些膜片應進行完整性測試，數值需符合或超出濾芯廠家給出的判定值，最終將結果記錄於報告中。表1是3M中國有限公司為某國內藥廠做的驗證服務記錄的相關數據，包含了細菌截留前和后的完整性數據，且都符合濾芯廠家給出的參考值。環境要求：為了消除周圍環境菌的影響，避免對後期的分析造成干擾，試驗要求在專門的微生物潔凈室內（class100000）進行，具體的整個試驗過程需要在二級生物安全櫃中進行，且整個潔凈間需要定期進行消毒。
除菌過濾濾芯選擇
目前液體除菌濾芯主要有聚醚碸膜（PES）濾芯（圖2），尼龍膜（Nylon）濾芯（圖3），聚偏氟乙烯膜（PVDF）濾芯，聚四氟乙烯膜（PTFE）濾芯等。濾膜又分親水膜和疏水膜，對於部分有機相溶劑料液，需要根據實際要求採用疏水膜過濾濾芯。在除菌濾芯的選擇上，藥廠主要根據濾芯供應商推薦或者依賴某個品牌。其實除菌濾芯選擇主要是由以下幾個因素決定的，這也再次論證了濾芯驗證服務的重要性。
*濾芯材質（化學兼容性）
*細菌截留率
*流速
*使用壽命
*熱穩定性
*化學穩定性細菌截留實驗介紹
根據ASTM838-83對除菌級濾芯的定義，用107CFU/cm2的缺陷性假單胞菌（ATCC19146）進行試驗，下游濾出液無菌。細菌挑戰試驗研究的目的就是通過實驗獲得文件證據，證明在模擬工藝條件下，過濾過程可以持續去除懸浮於產品或替代流體中的高水平的標準細菌或相關微生物污染分離物。
細菌截留試驗進行前，需要先進行細菌存活性試驗，來了解客戶產品在模擬的工藝條件下對截留菌生長的影響，試想如果客戶產品在模擬工藝條件下，會對截留菌生長造成影響，甚至無法存活，那分析濾膜未發現截留菌，是產品對截留菌的影響造成還是測試濾膜過濾的緣故都無從而知，因此細菌存活性試驗是截留試驗的預實驗，可以為截留試驗提供重要的理論依據，以此來確定截留試驗的過程，是採用單步還是多步進行試驗。
細菌截留試驗測試過程中使用如圖4所示裝置，一共包括CTL1-4四套截留裝置，CTL1-3即為所要驗證濾芯的三個重複，CTL-4為整個實驗的對照組，其中TF1，2，3分別為不同批號的測試濾膜，為過濾精度為0.22微米或者0.2微米的除菌濾膜，且每個TF上下游都加裝壓力表，用於監控整個實驗過程中，測試濾膜兩端的壓力，TF4為對照，為過濾精度為0.45微米的濾膜，AF-1，2，3，4均為分析濾膜。實驗過程中將產品或者替代液配置成一定濃度的挑戰液，一般要求不低於107CFU/cm2，按照模擬的縮小化工藝條件，採用蠕動泵將其按照一定的速度通過測試和分析濾膜，在試驗過程中，需要在不同時間點，對壓力，流速，溫度等關鍵參數進行監控並記錄，且在細菌截留試驗開始前和結束后，對微生物進行平板菌落計數確定挑戰菌的濃度。
當截留試驗結束后，需要將分析濾膜放於平板上培養，如果上游的測試濾膜為除菌濾膜，即圖中的TF1，2，3，則下游即分析濾膜上不會發現截留菌生長，如果上游的測試濾膜為非除菌濾膜即TF-4，則下游即分析濾膜上會發現挑戰菌生長。根據分析濾膜上是否有挑戰菌生長進行判斷，對於對照CTL-4，因0.45微米濾膜對於挑戰菌濃度在104～106CFU/cm2時，無法達到除菌過濾的效果，所以對照組下游的分析濾膜，即AF-4必定會有挑戰菌的生長，這樣一則可以對挑戰菌進行鑒定，鑒定該挑戰菌的純度及形態特徵，二則可以判斷挑戰液的濃度是否已經達到預期的濃度。實驗結果與分析
細菌截留實驗結果包括細菌截留前後膜片完整性測試值，陰性對照結果，產品循環工藝參數和分析膜片結果四個部分。如表1記錄了實驗膜片完整性測試結果，從中可以對截留試驗前和后，濾膜的完整性數據進行評估，是否符合濾芯廠家對於該類濾芯的完整性要求。表2陰性對照結果，需要確認在未接種截留菌前整個截留裝置是否保持無菌。表三為分析濾膜結果，也是決定細菌截留試驗成敗的關鍵指標，分為兩部分，第一部分為截留菌的濃度，需按要求菌不低於107CFU/cm2，可以分析達到了ASTM-838對除菌級濾芯截留濃度的要求，另外一部分為分析濾膜的結果，對於TCL-1，2，3裝置中AF均未發現截留菌，說明TF可以恆定高效的去除挑戰液中的截留菌，對於對照組的TCL-4下游的AF4，則發現有截留菌生長，可以利用特定的鑒定試劑盒，對結果進行鑒定，確認下游所發現的細菌有且僅為我們的標準截留菌。結論
通過實驗結果的闡述和分析，需要對此次細菌驗證實驗進行總結。3M中國有限公司提供的細菌截留實驗報告中會呈現三條總結，以下為某細菌截留實驗報告總結。
1.某公司使用3M除菌濾芯（如LifeASSURE?PDAPDA020F50JA）進行某藥液的除菌過濾。試驗在3M中國過濾驗證服務中心進行，本報告闡述了在模擬生產工藝條件下細菌挑戰試驗的測試結果。
2.當缺陷性假單胞菌的挑戰濃度高於107CFU/cm2時，所有測試膜片的濾出液全部無菌，測試結果符合判定標準。
3.某公司在某藥液生產中使用LifeASSURE?PDAPDA020F50JA濾芯進行除菌過濾，可以去除高水平負荷的缺陷性假單胞菌（ATCC19146）。
