核酸的電泳與檢測

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tags:    時間:2014-03-11 18:37:46
核酸的電泳與檢測簡介
    實驗目的】(1)了解核酸瓊脂糖凝膠電泳的原理,學會其具體的操作程序。(2)對提取的DNA進行檢測,掌握紫外電泳圖譜的觀察分析方法。【實驗原理】瓊脂糖凝膠……
核酸的電泳與檢測正文
    
實驗目的】
(1)了解核酸瓊脂糖凝膠電泳的原理,學會其具體的操作程序。
(2)對提取的DNA進行檢測,掌握紫外電泳圖譜的觀察分析方法。
【實驗原理】
瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法。帶電荷的物質在電場中的定向運動稱為電泳,核酸分子是兩性解離分子,在pH8.0時,DNA分子帶負電荷在電場中向正極移動。採用瓊脂糖凝膠介質作為電泳支持物,長度不同的DNA分子由於受凝膠阻遏作用大小不一,遷移速度不同,從而達到有效分離DNA的目的。
【儀器、材料、試劑】
(一)儀器
1.電泳裝置:電泳儀、水平電泳槽、梳子、制膠槽
2.紫外觀察:凝膠成像系統
3.高速離心機
(二)材料
1.瓊脂糖
2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
3.硼酸
4.乙二胺四乙酸(EDTA)
5.溴酚藍
6.蔗糖
7.溴化乙錠(EB)
8.DNA Marker(λDNA)
9.稱量紙、容量瓶、瓷盤、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒(100mL)、Tip頭(10uL)、膠帶
(三)試劑配製
1.5×TBE(pH8.0)(電泳緩衝液) 1000 ml
配製方法:
稱取Tris 54g、硼酸 27.5 g,再加入20ml的0.5mol/LEDTA加三蒸水定容至
1000ml搖勻后,轉到準備好的輸液瓶中,貼上標籤,高壓滅菌后,降至室溫,4℃保存備用。
2.凝膠加樣緩衝液(6×)(指示劑) 100 ml
稱取溴酚藍0.25 g、蔗糖40 g然後加入三蒸水定容至100ml搖勻后,4℃保存備用。
【實驗步驟】
(一)、制膠
1.稱取0.4g(適量)瓊脂糖置於三角瓶中,加入50ml 0.5×TBE緩衝液。
2.微波爐加熱,煮沸、振搖,反覆加熱、振搖2-3次,使瓊脂糖充分融化。
3.膠帶將膠床兩端粘好,底部粘嚴,以防凝膠滲漏,插好梳子。
4.待膠冷卻至60℃左右時,將融化的瓊脂糖小心地倒入膠床中,速度要快,讓 膠自然冷卻至完全凝固(約需要20-30分鐘)。
5. 小心向上方拔出梳子,避免前後左右搖晃,以防破壞膠面及加樣孔,去掉制膠槽兩邊的膠帶,小心將膠和膠床放入電泳槽中,樣品孔在陰極端。
6. 向電泳槽中加入0.5×TBE電泳緩衝液,液面高於膠面約1-2mm。
(二)、上樣電泳
1、取2μl上樣液(溴酚藍指示劑)於Parafilm上,加2μl水與2μl樣品DNA反覆吹吸,混勻。
2、Tip頭垂直伸入液面下膠孔中,小心上樣於孔中。
3、接通電源,打開高壓開關,電泳開始以正、負極鉑金絲有氣泡出現為準。
4、根據指示劑遷移的位置,判斷是否中止電泳。切斷電源后,再取出凝膠。
5、凝膠取出後於含EB的溶液中染色20分鐘。
(三)、凝膠紫外觀察:
染色后的凝膠取出於紫外監測儀或凝膠成像系統中觀察,照相,保存,記錄結果。
【注意事項】
1. 瓊脂糖融化時,檔位不宜太高。
2. 制膠和加樣過程中要防治氣泡的產生。
3. EB具有強誘變性,可致癌。必須戴手套操作,嚴格注意防護。
4. 加樣時,Tip頭不宜插入樣品孔太深,也不要穿破膠孔壁,否則樣品滲漏或
DNA帶型不整齊。
5. 電源接通時,應核實凝膠的方向是否正確。
6. 電泳儀有電壓顯示,並不一定標誌電泳槽已接通,應觀察電極氣泡出現情況。
負極的氣泡比正極多一倍,表示電泳已開始。
7. 溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中,在紫外光的照射下,插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色熒光,所以溴化乙錠可以作為熒光指示劑指示DNA含量和位置。
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