離心技術原理與類型

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離心技術原理與類型簡介
    離心是蛋白質、酶、核酸及細胞亞組分分離的最常用的方法之一,也是生化實驗室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經成為研究生物大分子實驗室中……
離心技術原理與類型正文
    
離心是蛋白質、酶、核酸及細胞亞組分分離的最常用的方法之一,也是生化實驗室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經成為研究生物大分子實驗室中的常用技術方法。
離心機(centrifuge)是實施離心技術的裝置。離心機的種類很多,按照使用目的,可分為兩類,即製備型離心機和分析型離心機。前者主要用於分離生物材料,每次分離樣品的容量比較大,後者則主要用於研究純品大分子物質,包括某些顆粒體如核蛋白體等物質的性質,每次分析的樣品容量很小,根據待測物質在離心場中的行為(可用離心機中的光學系統連續地監測),能推斷其純度、形狀和相對分子質量等性質。這兩類離心機由於用途不同,故其主要結構也有差異。

離心原理
將樣品放入離心機轉頭的離心管內,離心機驅動時,樣品液就隨離心管做勻速圓周運動,於是就產生了一個向外的離心力。由於不同顆粒的質量、密度、大小及形狀等彼此各不相同,在同一固定大小的離心場中沉降速度也就不相同,由此便可以得到相互間的分離。
離心力和相對離心力
溶液中的固相顆粒做圓周運動時產生一個向外離心力,其定義為:
F = mω2r
式中:
F 為離心力的強度; m 為沉降顆粒的有效質量;
ω 為離心轉子轉動的角速度,其單位為rad/s;
r 為離心半徑(cm),即轉子中心軸到沉降顆粒之間的距離。
很顯然,離心力隨著轉速和顆粒質量的提高而加大,而隨著離心半徑的減小而降低。目前離心力通常以相對離心力Fcf 表示,即離心力F 的大小相對於地球引力(G)的多少倍,單位為g,其計算公式如下:
Fcf = 1.119×105(h)2r×g
可以看出,在同一轉速下,由於f 的不同,Fcf相差會很大,實際應用時一般取平均值。在離心實驗的報告中,Fcf、r 平均、離心時間t 和液相介質等條件都應表示出來,因為它們都與樣品的沉降速度有直接的聯繫。顯然Fcf是一個只與離心機相關的參數,而與樣品並無直接的關係。
沉降速度與沉降係數
一個顆粒要沉降,它必須置換出位於它下方等體積的溶液,這隻有當顆粒的質量大於被置換出的液體的質量時才能通過離心的手段達到,否則,在離心過程中顆粒將發生向上漂浮,而不是下沉。當顆粒在運動時,不論方向如何,它都要穿過溶劑分子,所產生的摩擦力總是與顆粒運動的方向相反。
摩擦力的大小與顆粒的運動速度成正比,並且受顆粒的大小、形狀及介質性質的影響:

式中:
f 為顆粒在濟劑中的摩擦係數.與顆粒的大小、形狀及介質性質相關;
v 為顆粒的沉降速度。
由於離心力的存在,顆粒將加速運動直到摩擦力與離心力相等。在這種情況下,顆粒所受到的凈作用力為零,顆粒將以最大速度運動。

式中 Mp 和M s 分別為顆粒的質量及等體積的溶劑的質量。
上式中的Mp 和M s 很難確定,為了建立分子大小與沉降係數之間的關係,引入了沉降係數這一新的概念。沉降係數定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度,它以svedberg單位計算,1S=1×10-13 s。例如,核糖核酸酶A 的沉降係數為1.85×10-13 s,即可記作1.85S。
近年來,在生物化學、分子生物學及生物工程等書刊文獻中,對於某些大分子化合物,當它們的詳細結構和分子量不很清楚時,常常用沉降係數這個概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30 s 亞基和50s 亞基,這裡的s 就是沉降係數,現在更多地用於生物大分子的分類,特別是核酸。
離心技術的類型

最大速度方法
(1)移動界面超速離心法
含幾個組分的樣品在足夠高的離心場中離心時,每種顆粒都達到其最大沉降速度,這時樣品開始分離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液,並形成對應於樣品各組分的一系列濃度界面,界面的移動相對於每種組分來說是特徵的。

雖然利用這種方法不一定能實現組分的純化分離,但可以通過監測界面的移動來測定各組分的沉降速度。要想實現組分間的分離,必須在所需樣品沉降之後停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中,並以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降,而被純化的樣品留在溶液中,經過反覆多次地離心才能得到純的樣品,這種方法就叫差示沉降離心法,它對細胞組分間的分離非常有用。也可以通過逐漸增大轉速的方法實現不同組分間的分離,

細胞勻漿差示分離
(a)細胞勻漿;(b)細胞碎片;(c)線粒體、過氧化物酶體、溶酶體;(d)微粒體、核糖體;(e)細胞液;(可溶性蛋白質及小分子生物)
(2)移動區帶超速離心法
差示離心法離心前各組分均勻分佈在整個溶液中,所以分離一般不理想,而移動區帶超速離心法是一種密度梯度(Dens 心Gradient)離心技術,在離心之前離心管中溶液的密度不同(從上到下密度增大),梯度介質中最大密度應小於樣品物質的最小密度,其特點是物質的分離取決於樣品物質顆粒的質量.即樣品物質的沉降係數,而不是取決於樣品物質的密度,因而適合於分離密度相近而大小和形狀不同的物質,這屬於一種非平衡態分離法。當樣品物質輕輕地鋪在密度梯度介質的液面上,起動離心機,在離心力的作用下,一定時間后便形成不同物質的區帶。當繼續離心時每個區帶會逐一達到管底,所以,在沉降最快的區帶到達管底之前要停止離心,並將每個區帶分部收集。最常用的製備密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化銫和硫酸銫等。
等密度方法
等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質的密度相等,實際上是在梯度密度介質中進行的。該技術的特點是沉降分離與樣品物質的大小和形狀無關,而取決於樣品物質的密度。這種方法非常類似於電泳中的PH 梯度等電聚焦方法,在離心時,顆粒依其密度的不同沉降或向上漂浮,直到移動到與自身的密度相同的溶劑梯度中為止,其結果是依樣品物質密度的不同在梯度溶劑中形成一個個區帶。
在實驗方法上可以採用預先製備密度梯度溶液的方法,一般先製備兩種儲備液,它們的濃度決定最終所形成梯度溶液的極限。可以通過分步減小密度,從離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續梯度溶液,也可以通過一個梯度混合器產生連續梯度密度。儲備液一般使用兩種密度的蔗糖溶液或兩種密度的氯化銫溶液來製備。樣品一般鋪在溶液的表面,然後開始離心。
在實驗方法上也可以採用平衡密度梯度法,在這種離心法中,介質的梯度不是預先配製,而是在離心過程中,由於離心力的作用而逐漸形成。樣品物質和氯化銫的濃鹽溶液充分混合均勻,離心開始之後,銫鹽由於離心力的作用,自離心管口至離心管底形成連續遞增的密度梯度。生物樣品中不同組分物質在離心過程中沉降或上浮以尋找與自身密度相同的溶液密度梯度區帶,不同的物質最終到達相應的區帶,從而實現分離。這種方法依賴於在離心場的作用下低分子量的銫鹽密度梯度的形成,一般需要長時間的離心(2~3天)。顯然,樣品物質的密度應介於介質梯度中最大和最小密度之間,否則,樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。
無論是採用哪種操作方式,最終都要分別收集處在每一區帶的樣品組分,一般可採用下述兩種方法實現:
(1)穿刺法
這是方便而又理想的部分收集方法。用一根金屬空心針從離心管底刺人管內,不同區帶內的組分自下而上地先後從針管內分別流出,然後用部分收集器分別收集。
(2)取代法
在離心管口加一個帶有收集導管的塞子,塞子上同時裝有一根輸液導管插入離心管的管底,從輸液管中注入高密度的離心介質.其密度高於離心管中所形成的最大密度。當取代液不斷注入時離心管中的溶液逐漸上升,並不斷從收集導管中流出,然後用部分收集器分別收集。
離心機類型
通常所使用的離心機根據轉子轉速大小的不同可分為普通離心機、高速離心機和超速離心機三類。
(1)普通離心機
一般來說,最大轉速不超過6000r/min 者屬普通離心機;如國產的80—1型,LXJ—Ⅱ型等。離心機轉速與相對離心力的測算,如圖2—37。
普通離心機轉子在室溫下運轉,轉子室內的溫度一般無法控制,轉子有固定角度式和懸挂吊格式。
離心時形成的固體沉澱層叫壓板,液相部分稱之為上層清液。用傾注法分離兩相。
(2)高速離心機
轉速可以達到25000r/min 者為高速離心機;轉速在25000r/min 以上者為超速離心機。高速離心機一般帶有製冷裝置,因而轉子室內的溫度可以控制。轉子室內的溫度一般控制在4℃為宜。。其中大容量連續流動離心機的主要用途是從大量培養物(5~500 L)中收集酵母及細菌等。另一類是低容量冰凍離心機,型號甚多,其最大容量可達3L。這類離心機有各種內部可變換的角式和甩平式轉頭,它們多用於收集微生物、細胞碎片、細胞、大的細胞器、硫酸銨沉澱物、免疫沉澱物酶的粗提液等。特別需注意的是,每次離心前,應根據轉頭型號和樣品多少,設置樣品高度。
(3)超高速離心機
普通和高速離心機主要用於分離製備生物大分子物質和亞細胞成分;超速離心機有超過500000×g的離心力,能使亞細胞器分級分離,可用於分離病毒,也可用於測定蛋白質、核酸的相對分子質量等。
根據功能不同,又可分製備性超速離心機和分析性超速離心機。
由於轉速高會產生大量的熱量,因而這種離心機都附有冷凍裝置,以降低轉子室內溫度。同時.轉子是在真空下運轉的,可以減小摩擦。分析性離心時,必須對固相顆粒沉降過程跟蹤監測。為此,超速離心機附有一套光學系統,光路與離心管垂直,並透過離心管內的溶液,同時測定光密度或透光率,也可以檢測沉降顆粒的沉降速度和移動界面。這些測定有助於對樣品的狀況進行分析。

①製備性超速離心機:
主要由驅動和速度控制、溫度控制、真空系統和轉頭四部分組成。
驅動和速度控制:大多數超速離心機的驅動裝置是由水冷或風冷電動機通過精密齒輪箱或皮帶變速,或直接用變頻馬達連接到轉頭軸構成。由於驅動軸的直徑僅僅0.476cm,這樣,在旋轉期間細軸可有一定的彈性彎曲,以便適應轉頭的輕度不平衡,而不至於引起震動或轉鈾損傷。利用變阻器和帶有旋速器的控制器來選擇轉頭的轉速。除速度控制系統以外,還有一個過速保護系統,以防止轉速超過轉頭最大規定轉速時引起的轉頭撕裂或爆炸。為此目的,離心腔總是用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制:其溫度控制是由安置在轉頭下面的紅外線射量感受器直接而連續地監測轉頭的溫度,以保證更準確更靈敏的溫度調控。

真空系統:當轉速超過4000 r/min 時,空氣與旋轉的轉軸之間的摩擦生熱成為嚴重的問題。為了消除這種熱源.超速離心機一般增添了真空系統。將離心腔密封,並通過兩個串聯工作的真空泵系統抽成真空。第一個工作泵與一般實驗室的機械真空泵相同,它可抽真空到13.33~666Pa。一旦離心腔內的壓力減低到33.33Pa 以下,水冷擴散泵也開始工作。利用這兩個泵,可使真空度達到並維持在0.13~0.26Pa。在摩擦力降低的情況下,速度才有可能升高到所需的轉數。

轉頭:製備性超速離心機採用的轉頭有各種各樣.一般可分為兩大類:角式轉頭和甩平式轉頭。角式轉頭的孔穴與旋轉軸心之間的角度在20~45度之間。這類轉頭的優點是具有較大的容量,速度較高。另一種甩平式轉頭則由一個轉頭上懸吊著6個自由活動的吊桶〔離心管套〕構成。當轉頭靜止時,這些吊柄垂直懸挂;當轉頭在離心力的作用下轉速達到200~800 r/min 時.吊桶即甩平到水平位置。

這種轉頭主要是為了密度梯度沉降法而設計的。其主要優點是梯度物質可放在保持垂直的離心管中,而離心時管子保持水平。在水平位置沉降到離心管不同區域的樣品呈現出橫過離心管的帶狀,而不像角式轉頭中那樣成角度。因此,當從轉頭中取出離心管時.不會像在角式轉頭中那樣,沉降成分重新定位。這類轉頭的缺點是:形成區帶所需的時間間矩長,②分析性超速離心機分析性超速離心機使用了特殊設計的轉頭和檢測系統,以便連續地監視物質在一個離心場的沉降過程。

分析性超速離心機的轉頭是橢圓形的,此轉頭通過一個有天性的軸聯接到一個高速的驅動裝置上。轉頭在一個冷凍的和真空的膠中旋轉。轉頭上有2~6個裝離心杯的小室,離心杯呈扇形,可上下透光。離心機中裝有一個光學系統,在整個離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監測離心杯中沉降著的物質。在預定的時間可以拍攝沉降物質的照片、杯中物質沉降過程中,重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡,在檢測系統的照相底板上產生了一個」峰」,出於沉降不斷進行,界面問前推進,因此峰也移動。從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。
分析性超速離心機主要用於生物大分子的相對分子質量測定,估算樣艙的純度和檢測生物大分子構象的變化等。
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