實驗離心技術新進展

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實驗離心技術新進展簡介
    引言 實用離心技術可分為二大類:一類是用於化工、製藥、食品、污水處理、油品處理。工業的大型製備用離心分離技術,所使用的離心機及其附件屬於大中型工業生產……
實驗離心技術新進展正文
    
引言

實用離心技術可分為二大類:一類是用於化工、製藥、食品、污水處理、油品處理。工業的大型製備用離心分離技術,所使用的離心機及其附件屬於大中型工業生產設備。其中管式離心機轉速較高,小型可達50,000rpm,較大型(每小時處理量在1.5 噸以 上)也可達15,000rpm(國外典型機如Sharples,國內如上海離心機研究所GQ,GF 系列);轉筒式離心機廣泛用於乳品,油品,工業廢水處理,最大處理量可達90 噸/小時轉速從每分鐘數千至數萬轉。(國外典型機多為α-Laval,westfalia 等牌號);轉鼓式工業離心機(廣泛用於製藥、食品如Krausmaffai 等);卧式螺旋卸料離心機(最高轉速5000rpm,最大處理量10 噸/小時,國外如Westfalia,國內如上海離心機研究所的LW 系列);以及轉速在3000rpm 以下的三足離心機等等。另一類是用於生物、醫學、化學、農業食品及製藥等試驗室研究、中間試驗、部分生物製藥行業的小批量生產的實驗離心技術。目的在分離和純化樣品(特別是生物體組份)並對樣品的某些特性進行分析。后一類離心設備的轉速從每分鐘數千轉到每分鐘十多萬轉,每次實驗處理的樣品量較少,但其設備由於轉速高(目前最高達 150000rpm),離心力大(目前已達1050000×g)對轉速、溫度、真空、離心程序、模擬方 法等要求高而使這類離心機構造複雜、並在機械製造、電子電器控制、製冷系統、真空系統、防護設備、轉頭及附件製造等各方面都保持著很高的技術與工藝水平。實驗離心方法由於樣品的分離要求各不相同以及為適應現代生物醫學研究的快速發展而形成了比較完善和具有 一定獨立性的實驗技術學科。
      實驗離心技術是一個比較年輕的學科。最早使用手搖離心機進行食品(比如乳酪生產),血液分離可以追溯到十九世紀;電動低速台式離心機的商品化始於1912 年;離心技術的奠 基人在實驗離心技術方面開拓性的工作創始於1920 年代;而高速、超速離心機的商品化生產、實驗離心技術的普遍應用則是從上世紀五十年代開始的。 現代工業的進步,促進了離心設備的開發,也有利於各種樣品(特別是生物體組份)離心分離方法的迅速推廣和應用。而現代生物醫學研究的進展和對研究、診斷手段的大量需求而使離心機生產行業欣欣向榮。二十世紀70 年代以後,低速、高速、超速離心機產品幾經更新 換代。目前,先進的超速離心機已經能夠產生相當於重力加速度100 多萬倍的離心場並能保 持此離心場連續運轉數十小時以上;新一代的超速離心機還能對各種生物樣品離心方法進行 模擬,以找到最佳的離心分離方案和進行諸如分子量、沉降係數的計算。最近幾十年在離心方法方面的研究成果使我們可以利用那些較為先進的離心設備完成絕大部分生物體組份的 分離和純化。

簡史:

綜觀近年來實驗離心技術的進步,可把一些重要事件分列如下:
1911~1912 年:開始生產和使用低速(3,000rpm 以下)的商品化台式離心機。(IEC) 1923~1926 年:瑞典UPPSALA 大學以Svedberg 為首的科學家試製了世界上第一台試驗型超 速離心機,45,000rpm,油透平驅動,不鏽鋼小轉頭,轉頭置於H2 浴中,1926 年開始運轉。
1929 年:Lamn 完成了沉降方程。計算了沉降速度。定義了沉降係數。
1932 年:細胞核的離心純化(Behrens)
1933 年:Beams,Pickels 研製成試驗型空氣透平驅動超速機。
1934 年:Bauer 用以上離心設備成功分離出黃熱病病毒。 Bensley 等純化了線粒體。
1940 年:Svedberg 與Pederson 出版了「超速離心」一書(文獻(1))概括總結了在此之前近20 年的研究成果,奠定了離心技術的理論基礎,Svedberg 被公認為實驗離心技術的奠基人,他因這方面的成就而獲得諾貝爾獎。
1940~1950:開始研究用於製備超速離心機的速率——區帶(Rate-Zonal)密度梯度離心法和用於分析超速離心的沉降速度法。(文獻(2))
1943 年:Pickels 研製成現代固定角式離心轉子。(文獻(2))
1951 年:Brakke 第一次發表了他對速率—區帶密度梯度離心法的研究成果,並在1960 年再次對這一方法作了綜合評述。(文獻(4))1951 年:Kahler 研製成功甩平(Swing-out)轉子。(文獻(5))
1946~1954 年:世界各主要離心機生產廠開始研製並準備商品化生產離心機。
1955 年以後:開始了超速、高速、低速大容量離心機以及分析用超速離心機的商品化生產。
1957 年:Meselson、
1959 年:Duve 等開發了等密度離心法。(6)(7)
1964~1966 年:Anderson 等開始建立轉子區帶離心技術並開發了低、高、超速區帶轉頭 (MSE)。在此基礎上,各種轉速的連續流離心分離也逐漸被利用和完善。(8)
1959 年:干涉光學系統(Richard 等),吸收光學系統(Nichols,)等方法被用於分析超 離心技術。(9)(10)
1975 年:垂直管轉子被開發並用於Dupont-Sorvall 油透平驅動的超速離心機。
1980 年:美籍華人B.H.Chung 等發表了血清脂蛋白的單次垂直管分離法的研究成果, 被學術界及醫學臨床應用至今。(11)
1981 年:美國Beckman 公司開發的用於細胞離心純化的「淘洗」轉頭(Elutriation rotor)供應市場。
1980 年代:由於各種新的分離方法的開發(如HPLC 等),分析超離心方法及設備開始 走下坡路。但近年來隨著大分子量(>500,000)樣品研究的需要,分析超離心又有卷 土重來之勢。 1980 年代:在激烈的市場競爭中德國Heraeus 公司及英國MSE 相繼停止了超速離心機 的生產。 1980 年代:為了適應大分子利用重金屬鹽等作等密度離心的需要,利用計算機優化設 計的部分轉頭對樣品密度的要求(在最高轉速時)由1.2g/cm3 提高到1.7 g/cm3
1984 年:由D.Rickwood 等編著的「Centrifugation」一書出版,對離心技術的各方面作了比較全面的論述。
1992 年:「Centrifugation」再版,增加了製備超速離心的計算機模擬計算並對生物大分 子的最新離心方法作了總結。(12)
1990 年代:各種離心機開始全面使用變頻電機直接驅動,超速離心機開始安裝半導體製冷元件。
2001 年:實驗超速離心機最高轉速達到150,000rpm,RCFmax 突破105 萬×g 大關。 超速離心機開發了專用模擬軟體並與PC 機聯用。 近期:日立開發了無比例保修十年的新型懸挂式驅動部,各種離心機開始裝用高亮度、大屏幕、多功能液晶顯示屏,超速離心機轉頭的壽命自動管理和自動延長系統投入使用。

最主要的離心機製造商:
美國:
·Beckman(現已與Coulter 公司合併為Beckman-Coulter)
·Sorvall(早期為Dupont Sorvall 后獨立為Sorvall 現已與德國Heraens 公司、CARR 公司和Jewett 合併為Kendro,現屬於Thermo-Electrom集團。
·IEC(老廠,以生產中、低檔產品為主)現也屬於Thermo-Electrom集團。
日本:
·HITACHI KOKI(日立工機)
·Kubota(久保田)
·Tomy(精工) 
·Kokusan(國產)
英國:
·MSE(老牌廠,80 年代后數年幾近停產,1990 年被日本Sanyo 公司收購定牌為Sanyo-MSE,近年來又開始生產離心機)
德國:
·Heraeus(現已與Sorvall 合併為Kendro,現屬於Thermo-Electrom集團)
·eppendorf(台式機)
·Sigma(小型機為主)
·Hettich(台式機為主)
·Hermle(小型機為主)
瑞士:
Kontron(目前已從中國市場隱退)
法國:
Jouan(高速以下,現屬於Thermo-Electrom集團)

目前國際市場上最先進的機型:

·超速離心機

(美)Beckman-Coulter Optima XL-A,XL-I 分析超速機型 Optima L 系列(經濟型): L-100K,L-90K,LE-80K,(老型號,1989年推出)Optima-MAX(台式) Nmax= 130,000rpm, RCFmax=1,019,000xgOptima-L-XP 系列 L-100XP,L-80XP
(日)Hitachi Koki CP-100WX,Nmax=10 萬rpm, RCFmax>800,000xg ,CP-90WX,CP-80WX(有與計算機聯用的模擬軟體, 在轉頭上自動記錄離心數據,轉頭壽命自動管理),CP70MX,70,000rpm CS150GXL,CS120GXL,Nmax=15 萬rpm (小型機,目前世界上轉速最高,離心力最大RCFmax=1050,000xg)
(美國)Sorvall Ultra WX100,90,80(主機由日本Htiachi生產) Nmax=10 萬rpm, RCFmax>800,000xg

·高速離心機
(日)Hitachi Koki CR-GII 系列(22,21)
(美)Thermo-Sorvall RC-6Plus(主機由日本Htiachi生產)
(美)Beckman-Coulter Avanti-J 系列
(法)Jouan KR22i(Thermo集團)

·低速大容量離心機:
(德)Thermo-Heraeus Cryofuge 6000i
(日)Hitachi Koki CR-7 系列
(美)Thermo-Sorvall RC-3BP,RC-12BP,RC-3C plus
(美)Beckman-Coulter J6 系列
(美)Thermo-IEC PR-7000M(直流電機,有碳刷)
(法)Thermo-Jouan KR4i

·小型高速離心機

(德)Thermo-Heraeus Biofuge Stratos、Primo/Primo R、LEGEND T/RT、MACH 1.6/1.6R、Labofuge 200/300/400/400 R、MULTIFUGE 4KR
(日)Hitachi Koki CF-RX 系列,CF-RXII 系列
(美)Beckman-Coulter Allegra 系列
(德)Sigma,2K 系列、3K 、4K、6K系列
(德)Hettich Universal 系列、EBA 系列、Rotina 系列
(德)Hermle Z-233MK-2/MK-2、Z323/323K、Z383/Z383K、Z513/513K、Z36HK、Z366160M、300/300K等等
(美)Thermo-Sorvall T-21
(德)eppendorf 5415、5417、5804、5810、5818、5824等等
(美)Thermo-IEC Multi-RF (法)Thermo-Jouan MR 系列、BR 系列

實驗離心機技術新進展:

設備:
近二十年離心機的轉速、離心力加速度、容量、使用壽命,都有了很大提高,在驅動器、轉頭、電子、電器空控制、製冷系統、整機配置及附件等各方面都有了長足進步。至今,我們可以說,對於已知或未知的生物體組份,用實驗離心設備進行分離純化已經沒有太多困難。現代離心設備除了直接按照使用者要求(轉速、時間、溫度、程序、轉頭等)進行離心實驗外,還可以對各種樣品的離心分離在離心前就離心條件進行探索和優化。 驅動部:有串激(或復激)直流有碳刷電機直接或間接(齒輪或皮帶增減速)驅動演變為如今的變頻電機直接驅動。

變頻電機直接驅動的優點是:在各種不同轉速都能輸出最大扭距(這樣就開發了如今的 很多種高-低速兼用型號,如一機多用提供了有效的驅動方式);維護和日常維修周期延長。原來的串激直流電機碳刷壽命一般在102~103 小時,碳刷的頻繁更換及整流器的加工給用戶 造成很多不便。使用變頻電機后,驅動部的維護周期對高速離心機來說提高到3000~5000 小時以上(軸承更換)而對沒有製冷設備的低速離心機和用油潤滑的超速離心機,驅動部的 免維護周期可提高到十年以上;降低了運轉雜訊。免除了碳刷與整流器摩擦產生的高頻雜訊。實現了室內安靜運轉。(如HITACHI CS-150GX 超速機在150,000rpm 運轉時雜訊指標為 48dbA 以下);實現了對轉速、加減速速率的數字化計算機控制,達到了很高的控制精度(如 100,000rpm 以下運轉轉速控制精度達到±10rpm);免除了碳粉污染,使得這類離心機可以進入無菌、無塵實驗室,這對某些生物樣品(如注射用藥、疫苗、生物製品)及血液(血庫、血站、血液中心)和醫學研究的離心分離尤其重要;此外,同等功率的變頻電機重量輕、體積小,便於裝卸和修理;電機本身結構簡單(和一般感應電機一樣)成本較低。驅動部減震功能的改進使驅動部壽命增加,使肉眼觀測液面水平而不用天平的常規離心操作 成為可能。

轉頭:

突出的改進表現在經計算機計算優化后的輕型轉頭;碳纖維材料製造的超速和大容量超輕轉頭;適用於生物大分子(DNA,RNA,蛋白等)離心分離用的小傾角轉頭(固定傾角 7°~10°);超高速,特大離心力轉頭等等。 
鋁合金製造的輕型大容量轉頭:以往的6×500ml 角轉頭自重24kg 以上,經過計算 機的三元有限元法計算優化后。同容量,同轉速(或更高)的轉頭重量只有14.5kg,大大減輕了操作者的負擔。
  碳纖維製造的超速及高速轉頭,重量輕,容量大。特別是在高速冷凍離心機中配置的 新型CF 角轉頭單管容量達到1000ml,總容量達到4~6l。 
 小傾角超速固定角轉頭既保持了垂直管轉頭沉降距離小,縱剖面面積大分離時間短的 優點,也兼有一般固定角或轉頭作梯度分離時純樣品區帶在減速過程中不接觸沉澱的特點,最適用於質粒DNA,染色體DNA,RNA 分離。 
 超大離心力轉頭的開發:縮短了某些難以分離的生物樣品的分離時間,減少了濃度擴 散的作用,提高了分離純度和解析度。微機控制;
與PC 機聯用的介面和軟體;轉頭壽命的自動管理和轉頭壽命的自動延長;更多的故障自我診斷與顯示;用戶使用功能的增加;某些實用離心功能的設置(如高速離心機轉頭溫度 的直接顯示、在預置轉速實際運轉時間控制(RTC);顯示屏上提供轉頭樣本及模擬計算圖形及數據;外接列印功能,聯網遙控功能,高低速離心轉頭自動識別功能,非接觸式不平衡保護、用戶鎖或密碼設定功能、預冷功能、轉頭自動鎖定功能等等);高亮度LCD 顯示屏等等。 離心技術應用軟體:
九十年代開始日立CP-α系列與Beckman XL 系列超速機開始設置模擬功能(沉降速度 法模擬與沉降平衡法模擬)本世紀初Hitachi Koki 的CP-MX 系列離心機又增加了供與PC 機聯用的模擬軟體。這樣就擴展了模擬計算功能。利用模擬可以在離心前對某一特定樣品選 擇最佳離心參數;在離心后根據某些已知參數計算樣品分子量、沉降係數、擴散係數、微分比容等等。這種機型還把轉頭歷次運轉的轉速、時間數據全部記錄在轉頭下部的磁環上,實現了真正意義上的轉頭壽命自動管理。
故障自我診斷與顯示:是現代離心機完美服務的一個特色。九十年代初一般離心機只 提供少量的故障自我診斷,其中大部分是保護功能。而如今的超速離心機已經能提供近百種故障的自我診斷結果,為排除故障提供了依據。(對部分稍有技術條件的單位可自行維修) 用戶使用功能的增加:如RCF 計算,ω 2t 自動計算與設置;在顯示屏上提供各種實用菜單。提供使用說明書上的部分內容等等。 顯示屏:九十年代前使用的LED 顯示屏,CRT 顯示屏及一般黑白LCD 顯示屏已改 為目前的高亮度彩色背景液晶顯示屏。清晰、柔和、解析度高,令人賞心悅目,06年起日立開始配置彩色觸幕屏。

製冷系統:

使用壓縮機製冷的高速、大容量和台式機都已實現了無氟製冷,並在最高轉速運轉時樣品溫度可保持在4℃~5℃以下。九十年代起Beckman 及Hitachi 的超速離心機開始使用半導 體製冷元件代替壓縮機製冷。體積小、雜訊低、溫控精度高是它的特點。而近年來又採用了第三代Peltier 效應電子熱泵,使半導體製冷元件的壽命提高到10 年以上。

離心方法新進展:

·實驗離心技術的數學計算:(包括沉降方程的建立,Svedberg 方程的建立,離心加速 度、沉降速度、沉降時間、沉降係數、分子量、擴散係數、微分比容、液體動壓力轉子K 係數Pi 係數等等)在70 年代以前已經建立;而離心方法(差分離心法、速率-區帶密度梯 度離心法,等密度離心法以及分析超離心的沉降速度法、沉降平衡法-包括紋影光學系統、干涉光學系統,吸收掃描光學系統等等)則在更早些時候就已經得到充分的研究。其中一些 簡單的運算已被廣大實驗人員熟練地運用。但涉及分子量、沉降係數、沉降速度、擴散係數等較為繁複的運算工作,只有極少數研究人員在用。微機在離心機上的應用以及PC 機的普 及從八十年代開始開發沉降平衡法及沉降速度法的計算機模擬,利用製備超速離心機和離心 技術的數學分析來探知生物樣品的沉降過程。在已知某些參考條件下計算S,M,D 等重要 參數。尤其是前者,對某些樣品的離心結果知之甚少的情況下,預先利用離心分離軟體來優化選擇離心參數有很高使用價值。值得注意的是某些離心機還專門為與PC 機聯用開發了模 擬軟體,既降低了離心主機的價格,又擴展了模擬計算範圍,收到了很好的效果。

·某些特定樣品離心方法的研究和推廣。如:質粒DNA 分離:用小角度轉頭,CSCL 加E.B.和Triton-x-100 的自形成梯度平衡等密度離心法(文獻12,13) ;血清脂蛋白的離心分離:包括單次垂直管離心法等等((11),(14)) ; 超高速、小容量的生物大分子快速離心分離法(文獻12)等等。

 參考文獻:

1) Svedberg,T. Pederson, K.「The Ultracentrifugation」OxfordUniversity press.(1940)
2) Pickels,E.G. J.Gen.Phys. 26, PP341~360 1943
3) Pickel,E.G. 「Centrifugation inBiophysical Research Methods」 Interscience,New York (1950)
4) Brakke,M.K. Adran.Virus.Res. Vol.7 193~224 (1960)
5) Kahler,M. J.Phys. Colloid Chem.55,1344-1350(1951)
6) Meselson,M 等 Proc.Nat.Acad.Sci. U.S. 43,581~588,(1957)
7) De Duve ,C.J. Cell Biol.Vol.50,No.1, 20~25(1959)
8) Anderson,N.G. Anal.Biochem. 31,255;32,460(1969)
9) Rechard, E.G. J.Phy.Chem. 63,1578(1959)
10) Nichols,J.B. 「Physical Methods of Organic Chemistry」 3rd ed. Pt.II, Interscience press.New York (1959)
11) B.H. Chung etc. J.Lip.Res. Vol:21 PP284~291 (1980)
12) D.Rickwood,B.D. Hames, 「Preparative Centrifugation- A Practical Approach 」 OxfordUniversity Press (1922)
13) 餘興明 「質粒DNA 的超速離心分離」 生命的化學,1994.1
14) 餘興明 「血清脂蛋白的離心分離技術」 生命的化學,1997.3
15)餘興明 「離心技術講座」(有21篇文章和大量的分離實例)2005-2006


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