HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。製備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。後來的高壓泵精度很高並可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極體陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工作站及網路處理系統。
目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
第一步：輸掖泵的選擇
輸液泵是HPLC系統中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可*性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量範圍寬，分析型應在0.1~10 ml/min範圍內連續可調，製備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300 kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。
泵的種類很多，按輸液性質可分為恆壓泵和恆流泵。恆流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往複泵和隔膜往複泵。恆壓泵受柱阻影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用最多的是柱塞往複泵。
柱塞往複泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易於清洗和更換流動相，特別適合於再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400 kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈衝性較大，現多採用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為並聯式和串聯式，一般說來並聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。
第二步：進樣器的選擇
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重複性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等於零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重複性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。
2．停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由於隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現「鬼峰」；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的製備色譜中，效果較好。
3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由於閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低於隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重複性好（0.5%），操作方便。
4．自動進樣。用於大量樣品的常規分析。
第三步：色譜柱的選擇
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用於HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對於一般的分析只需5000塔板數的柱效；對於同系物分析，只要500即可；對於較難分離物質對則可採用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足複雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（儘可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，*近管壁的部位比較疏鬆，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大於管壁效應。
1．柱的構造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不鏽鋼製成，壓力不高於70 kg/cm2 時，也可採用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不鏽鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不鏽鋼柱內壁塗敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯裡的，用於細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不鏽鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm(5~10μm)，取決於填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和製備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半製備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室製備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產製備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和摺合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。
2．柱的發展方向
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小於0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易於實現LC-MS聯用。
但由於柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至採用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量，進樣閥能準確、重複地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。
3．柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20μm時，干法填充製備柱較為合適；顆粒＜20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用於分析柱和小規模製備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用於裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在於填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重複性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重複性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
第四步：檢測器的選擇
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性範圍寬、重複性好和適用範圍廣。
1．分類
1）按原理可分為光學檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射）、熱學檢測器（如吸附熱）、電化學檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學檢測器（電導、介電常數、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。
2）按測量性質可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。
3）按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。
4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2．性能指標
1）噪音和漂移：在儀器穩定之後，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那麼它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。
2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
3）檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，並不等於它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮雜訊的大小，而檢測限與雜訊的大小是直接有關的。
檢測限指恰好產生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml；對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為雜訊，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的雜訊和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。
4）線性範圍(linear range)：指檢測器的響應信號與組分量成直線關係的範圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應信號的最大與最小的範圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性範圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準確與否，關鍵在於檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關係。輸出信號與樣品量最好呈線性關係，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一台檢測器能在任何範圍內呈線性響應。通常A＝BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定範圍內才接近於1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。
線性範圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性範圍儘可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
5）池體積：除製備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小於10μl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2μl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。
第五步：數據處理和計算機控制系統
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其後，使用積分儀計算並列印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①採集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。
第六步：恆溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恆溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恆溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配係數K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程並降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響並不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質（如緩衝劑）加入流動相中以調節其分配係數，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決於溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
